血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定
(本公司常年供应Bovogen的牛γ-球蛋白)
一、原理
血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类:清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白,其中γ-球蛋白含量约占16%,100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离,此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出,清蛋白则仍溶解在溶液中,经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐,会妨碍蛋白质进一步纯化,因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法,其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时,溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔,而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中.因此在洗脱过程中,小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来,从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们等电点的不同可进行分离。α-球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0;γ-球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中,各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时,带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合;带正电荷的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ-球蛋白,从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。
用上述方法分离得到γ-球蛋白是否纯净,单一?可将纯化前后的γ-球蛋白白进行电泳比较而鉴定之。
二、操作
(1)盐析――中性盐沉淀
取正常人血清2.0ml于小试管中,加0.9%氯化钠溶液2.0ml,边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml,混匀后于室温中放置10min,3000r/min离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液,重复洗涤一次,于沉淀中加入0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5~1.Oml使之溶解。此液即为粗提的γ-球蛋白溶液。
(2)脱盐――凝胶柱层析
①装柱:洗净的层析柱保持垂直位置,关闭出口,柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内,打开柱底部出口,调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部,最后使凝胶床达20厘米高,床面上保持有洗脱液,操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸,以免加入液体时冲起胶粒。
②上样与洗脱:可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整,小心控制凝胶柱下端活塞,使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面,关紧下端出口,用长滴管吸取盐析球蛋白溶液,小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口,将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口,小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口,待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次,以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵,流速为0.5ml/min,用部分收集器收集,每管1ml。
③洗脱液中NH4+与蛋白质的检查:取比色板两个(其中一个为黑色背底),按洗脱液的顺序每管取一滴,分别滴入比色板中,前者加20%磺基水杨酸溶液2滴,出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出,由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度;于另一比色板中,加人奈氏试剂应用液l滴,以观察NH4+出现的情况。合并球蛋白含量高的各管,混匀。除留少量作电泳鉴定外,其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。
(3)纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析:用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度,并用0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡,然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上,用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20%磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱,收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。
(4)浓缩――经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的γ-球蛋白液往往浓度较低。为便于鉴定,常需浓缩。收集较浓的纯化的γ-球蛋白溶液2m1,按每ml加0.2~ 0.25gSephadex G一25干胶,摇动2~3min, 3000r/min 离心5min。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。
(5)鉴定――乙酸纤维素薄膜电泳 取乙酸纤维素薄膜2条,分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液等样品点上。然后比较电泳结果。
三、Bovogen的牛γ-球蛋白
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